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L'ingegneria genetica

Le tecniche di ingegneria genetica permettono di modificare artificialmente il DNA di un organismo, soprattutto per

ottenere organismi ricombinanti (con DNA ricombinante) ovverosia organismi che contengono geni provenienti da altri organismi, anche molto diversi
ottenere organismi con geni modificati (es. per curare una malattia genetica)
silenziare geni per comprenderne meglio il funzionamento

Per comprendere le tecniche di base utilizzate per lavorare con gli acidi nucleici, ricorda che gli acidi nucleici sono macromolecole composte da nucleotidi (uno zucchero, un fosfato e una base azotata) legati da legami fosfodiesterici. I gruppi fosfato su queste molecole hanno ciascuno una carica netta negativa. Un intero set di molecole di DNA nel nucleo è chiamato genoma. Il DNA ha due filamenti complementari legati da legami idrogeno tra le basi accoppiate. L'esposizione ad alte temperature (denaturazione del DNA) può separare i due filamenti e il raffreddamento può ricomporli. L'enzima DNA polimerasi può replicare il DNA. A differenza del DNA, che si trova nel nucleo delle cellule eucariotiche, le molecole di RNA lasciano il nucleo. Il tipo più comune di RNA che i ricercatori analizzano è l'RNA messaggero (mRNA) perché rappresenta i geni che codificano le proteine che sono attivamente espressi. Tuttavia, le molecole di RNA presentano altre sfide all'analisi, poiché sono spesso meno stabili del DNA.

L'ingegneria genetica è l'alterazione del genotipo di un organismo mediante la tecnologia del DNA ricombinante per modificare il DNA di un organismo al fine di ottenere caratteristiche desiderabili. L'aggiunta di DNA estraneo sotto forma di vettori di DNA ricombinante generati tramite clonazione molecolare è il metodo più comune di ingegneria genetica. L'organismo che riceve il DNA ricombinante è un organismo geneticamente modificato (OGM). Se il DNA estraneo proviene da una specie diversa, l'organismo ospite è transgenico . Gli scienziati hanno modificato geneticamente batteri, piante e animali sin dai primi anni '70 per scopi accademici, medici, agricoli e industriali. Negli Stati Uniti, gli OGM come la soia Roundup-ready e il mais resistente alla piralide fanno parte di molti comuni alimenti trasformati.

Estrazione di DNA e RNA

Per studiare o manipolare gli acidi nucleici, bisogna prima isolare o estrarre il DNA o l'RNA dalle cellule. I ricercatori usano varie tecniche per estrarre diversi tipi di DNA (immagini in galleria ). La maggior parte delle tecniche di estrazione degli acidi nucleici prevede passaggi per rompere la cellula e usare reazioni enzimatiche per distruggere tutte le macromolecole indesiderate (come la degradazione delle molecole indesiderate e la separazione dal campione di DNA). Un tampone di lisi (una soluzione che è per lo più un detergente) rompe le cellule. Nota che lisi significa "dividere". Questi enzimi rompono le molecole lipidiche nelle membrane cellulari e nelle membrane nucleari. Enzimi come proteasi e ribonucleasi (RNAsi) scompongono rispettivamente proteine e RNA. L'uso di alcol precipita il DNA. Il DNA genomico umano è solitamente visibile come una massa gelatinosa e bianca. È possibile conservare i campioni di DNA congelati a -80 °C per diversi anni.

Gli scienziati eseguono l'analisi dell'RNA per studiare i modelli di espressione genica nelle cellule. L'RNA è naturalmente molto instabile perché le RNAsi sono comunemente presenti in natura e molto difficili da inattivare. Similmente al DNA, l'estrazione dell'RNA comporta l'uso di vari buffer ed enzimi per inattivare le macromolecole e preservare l'RNA.

Schema dell'estrazione del DNA
DNA estratto
Estrazione del DNA dalla fragola
DNA della fragola estratto

Enzimi di taglio e cuci

Enzimi per tagliare

Un enzima di restrizione (endonucleasi) è un enzima che taglia il DNA in punti specifici. Agisce in prossimità o a livello di sequenze nucleotidiche di riconoscimento specifiche note come "siti di restrizione". Per tagliare il DNA, tutti gli enzimi di restrizione eseguono due incisioni, una attraverso ogni filamento della doppia elica del DNA.

Questi enzimi si trovano nei batteri e negli archea e li difendono dai virus invasori , che sono batteriofagi .

All'interno di un procariote , gli enzimi di restrizione tagliano selettivamente il DNA estraneo in un processo chiamato restrizione . Il DNA ospite è protetto da un altro enzima che protegge il DNA ospite e blocca la scissione. Insieme, questi due processi costituiscono il sistema di modifica della restrizione . È il sistema immunitario più antico e semplice . Sono anche una specie di elemento genetico egoista e mobile .

Sono stati studiati in dettaglio oltre 3000 enzimi di restrizione e più di 600 di questi sono disponibili in commercio. Questi enzimi sono utilizzati di routine per la modifica del DNA nei laboratori e sono uno strumento fondamentale nella clonazione molecolare.

Tra i vari tipi di endonucleasi quelli più usati in laboratorio sono quelli di classe II. Ciascun enzima di classe II possiede una propria sequenza bersaglio (detto anche sito di restrizione), che riconosce e taglia. Questa sequenza, solitamente di 4-8 paia di basi, è detta sito di restrizione e permette di tagliare il DNA a livello di quel sito. Si tratta di siti con sequenze palindromiche: se lette secondo la stessa polarità, sono identiche nei due filamenti (ad es. 5'...GATC...3' è palindromica perché il suo complementare è 3'...CTAG...5', che letta da 5' a 3' corrisponde a GATC).

Sono possibili due tipi di taglio: il taglio sfalsato ed il taglio orizzontale.

Il taglio sfalsato. Un esempio può essere il taglio effettuato dall'enzima di restrizione EcoRI (si legge eco-erre-uno) di E. coli. L'enzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità (dette coesive o sticky ends) a singolo filamento al 5'. Le estremità coesive (cioè "appiccicose") che si sono create, possono appaiarsi con sequenze complementari.

Il taglio orizzontale. Esempio di questo tipo di taglio è l'enzima SmaI (si legge sma-uno). Il taglio di SmaI non produce estremità coesive, ma estremità "piatte" (blunt ends):



SmaI restriction enzyme recognition site	EcoRI restriction enzyme recognition site
Sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione SmaI, col taglio in verde	Sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione EcoRI col taglio in verde

Enzimi per attaccare

La DNA ligasi è divenuta uno strumento indispensabile nelle moderne tecniche dell'ingegneria genetica per la produzione di DNA ricombinante. Per esempio è possibile unire, attraverso una ligasi, plasmidi e geni liberi in soluzione (tagliati con lo stesso enzima di restrizione al fine di produrre estremità complementari e coesive). Questa tecnica, chiamata subclonaggio, consente di inserire un gene d'interesse all'interno di un plasmide che potrà essere, a sua volta, clonato in un organismo ospite.

uno schema di come funziona una ligasi (con estremità appiccicose )

Uno dei parametri decisivi perché le operazioni con le DNA ligasi siano ottimali è la corretta temperatura. La maggior parte degli esperimenti è svolta con la DNA ligasi T4 (isolata dal batteriofago T4, un virus), che ha un'efficienza ottimale a 25 °C.

Separare frammenti diversi di DNA: l'elettroforesi su gel

Poiché gli acidi nucleici sono ioni caricati negativamente a pH neutro o basico in un ambiente acquoso, un campo elettrico può mobilitarli. L'elettroforesi su gel è una tecnica che gli scienziati usano per separare le molecole in base alle dimensioni, usando questa carica. Si possono separare gli acidi nucleici come cromosomi interi o frammenti. Il DNA ha una carica negativa netta e si sposta dall'elettrodo negativo verso l'elettrodo positivo. La corrente elettrica viene applicata per un tempo sufficiente a consentire al DNA di separarsi in base alle dimensioni. Gli acidi nucleici si caricano in una fessura vicino all'elettrodo negativo della matrice di gel semisolido e poroso e vengono tirati verso l'elettrodo positivo all'estremità opposta del gel. Le molecole più piccole si muovono attraverso i pori del gel più velocemente delle molecole più grandi. Questa differenza nella velocità di migrazione separa i frammenti in base alle dimensioni. Ci sono campioni standard di peso molecolare che i ricercatori possono far funzionare insieme alle molecole per fornire un confronto delle dimensioni. Possiamo osservare gli acidi nucleici in una matrice di gel usando vari coloranti fluorescenti o colorati. Frammenti distinti di acidi nucleici appaiono come bande a distanze specifiche dalla parte superiore del gel (l'estremità dell'elettrodo negativo) in base alle loro dimensioni ( Figura in galleria). Una miscela di frammenti di DNA genomico di diverse dimensioni appare come una lunga striscia; mentre il DNA genomico non tagliato è solitamente troppo grande per scorrere attraverso il gel e forma un'unica grande banda nella parte superiore del gel.

Elettroforesi su gel
Il gel di agarosio
preparazione
La vaschetta con i due poli elettrici
Risultato di una elettroforesi
Con la luce UV le bande si vedono meglio

Clonare geni, batteri, organismi

Clonare frammenti di DNA o geni

In generale, la parola "clonazione" significa la creazione di una replica perfetta; tuttavia, in biologia, la ricreazione di un intero organismo è definita "clonazione riproduttiva". Molto prima che si tentasse di clonare un intero organismo, i ricercatori hanno imparato a riprodurre regioni o frammenti desiderati del genoma, un processo che è definito clonazione molecolare. La tecnica ha offerto metodi per creare nuovi farmaci e superare le difficoltà con quelli esistenti. Quando Lydia Villa-Komaroff, che lavorava al Gilbert Lab di Harvard, ha pubblicato il primo articolo che delineava la tecnica per produrre insulina sintetica, i ricercatori e i pazienti del diabete hanno ricevuto una nuova speranza nella lotta contro la malattia. A quel tempo, l'insulina veniva prodotta solo utilizzando pancreas di maiale e mucca e la sostanza salvavita era spesso scarsa. L'insulina sintetica, una volta prodotta in serie, avrebbe risolto quel problema per molti pazienti. Queste prime scoperte hanno portato al "BioTech Boom" e hanno stimolato la ricerca e il finanziamento continui per modi più nuovi e migliori per migliorare la salute.

La clonazione di piccoli frammenti di genoma consente ai ricercatori di manipolare e studiare geni specifici (e i loro prodotti proteici) o regioni non codificanti in isolamento. Un plasmide, o vettore, è una piccola molecola di DNA circolare che si replica indipendentemente dal DNA cromosomico. Nella clonazione, gli scienziati possono utilizzare le molecole plasmidiche per fornire una "cartella" in cui inserire un frammento di DNA desiderato. I plasmidi vengono solitamente introdotti in un ospite batterico per la proliferazione. Nel contesto batterico, gli scienziati chiamano il frammento di DNA dal genoma umano (o dal genoma di un altro organismo studiato) DNA estraneo , o transgene, per differenziarlo dal DNA del batterio, o dal DNA dell'ospite.

I plasmidi si trovano naturalmente nelle popolazioni batteriche (come Escherichia coli ) e hanno geni che possono conferire tratti favorevoli all'organismo, come la resistenza agli antibiotici (la capacità di non essere influenzati dagli antibiotici). Gli scienziati hanno riutilizzato e progettato i plasmidi come vettori per la clonazione molecolare e la produzione su larga scala di reagenti importanti, come l'insulina e l'ormone della crescita umano. Una caratteristica importante dei vettori plasmidici è la facilità con cui gli scienziati possono introdurre un frammento di DNA estraneo tramite il sito di clonazione multipla (MCS) . L'MCS è una breve sequenza di DNA contenente più siti che diverse endonucleasi di restrizione comunemente disponibili possono tagliare. Le endonucleasi di restrizione riconoscono sequenze di DNA specifiche e le tagliano in modo prevedibile. L'aggiunta dell'enzima DNA ligasi unisce in modo permanente i frammenti di DNA tramite legami fosfodiesterici. In questo modo, gli scienziati possono unire qualsiasi frammento di DNA generato dalla scissione dell'endonucleasi di restrizione tra le due estremità del DNA plasmidico che è stato tagliato con la stessa endonucleasi di restrizione. Il plasmide pBR322 è stato uno dei primi plasmidi ad essere ampiamente utilizzato come vettore di clonazione . Nel diagramma del plasmide in galleria sono mostrati i geni codificati ( amp e tet per la resistenza all'ampicillina e alla tetraciclina , rispettivamente), la sua origine di replicazione ( ori ) e vari siti di restrizione (indicati in blu) dove le endonucleasi possono tagliare.

I plasmidi sono piccoli anelli di DNA naturalmente presenti nei batteri
I plasmidi si possono duplicare e si possono integrare nel DNA batterico
plasmide
Il plasmide PBR322
Le tappe della colazione molecolare

Esercizio
Stai lavorando in un laboratorio di biologia molecolare e, a tua insaputa, il tuo partner di laboratorio ha lasciato il DNA genomico estraneo che stai pianificando di clonare sul banco del laboratorio durante la notte invece di conservarlo nel congelatore. Di conseguenza, è stato degradato dalle nucleasi, ma è stato comunque utilizzato nell'esperimento. Il plasmide, d'altro canto, è a posto. Quali risultati ti aspetteresti dal tuo esperimento di clonazione molecolare? Non ci saranno colonie sulla piastra batterica. Ci saranno solo colonie blu. Ci saranno colonie blu e bianche. Ci saranno solo colonie bianche

Clonare batteri o lieviti

Gli organismi unicellulari, come batteri e lieviti, producono naturalmente cloni di se stessi quando si replicano asessualmente tramite fissione binaria; questo è noto come clonazione cellulare . Il DNA nucleare si duplica tramite il processo di mitosi, che crea una replica esatta del materiale genetico.

La clonazione dei batteri (scissione binaria)
Clonazione del lievito

Clonare organismi pluricellulari (mammiferi in particolare)

La clonazione riproduttiva è un metodo utilizzato dagli scienziati per clonare o copiare in modo identico un intero organismo multicellulare. La maggior parte degli organismi multicellulari si riproduce per via sessuale, il che implica l'ibridazione genetica di due individui (genitori), rendendo impossibile generare una copia identica o un clone di uno dei genitori. I recenti progressi nella biotecnologia hanno reso possibile indurre artificialmente la riproduzione asessuata dei mammiferi in laboratorio.

La partenogenesi, o "nascita verginale", avviene quando un embrione cresce e si sviluppa senza la fecondazione dell'uovo. Questa è una forma di riproduzione asessuata. Un esempio di partenogenesi avviene in specie in cui la femmina depone un uovo e se l'uovo viene fecondato, è un uovo diploide e l'individuo si sviluppa in una femmina. Se l'uovo non viene fecondato, rimane un uovo aploide e si sviluppa in un maschio. L'uovo non fecondato è un uovo partenogenico o vergine. Alcuni insetti e rettili depongono uova partenogeniche che possono svilupparsi in adulti.

La riproduzione sessuale richiede due cellule. Quando l'ovulo aploide e lo spermatozoo si fondono, si forma uno zigote diploide. Il nucleo dello zigote contiene le informazioni genetiche per produrre un nuovo individuo. Tuttavia, lo sviluppo embrionale precoce richiede il materiale citoplasmatico contenuto nell'ovulo. Questa idea costituisce la base per la clonazione riproduttiva. Pertanto, se sostituiamo il nucleo aploide dell'ovulo con un nucleo diploide dalla cellula di un qualsiasi individuo della stessa specie (un donatore), diventerà uno zigote geneticamente identico al donatore. Il trasferimento nucleare di cellule somatiche è la tecnica di trasferimento di un nucleo diploide in un ovulo enucleato. Gli scienziati possono utilizzarlo sia per la clonazione terapeutica che per la clonazione riproduttiva.

Il primo animale clonato è stato Dolly, una pecora nata nel 1996. Il tasso di successo della clonazione riproduttiva all'epoca era molto basso. Dolly visse per sette anni e morì per complicazioni respiratorie (Figura accanto). Si ipotizza che, poiché il DNA cellulare appartiene a un individuo anziano, l'età del DNA possa influenzare l'aspettativa di vita di un individuo clonato. Dopo Dolly, gli scienziati hanno clonato con successo diversi animali come cavalli, tori e capre, sebbene questi animali presentino spesso anomalie facciali, degli arti e cardiache. Ci sono stati tentativi di produrre embrioni umani clonati come fonti di cellule staminali embrionali per scopi terapeutici. La clonazione terapeutica produce cellule staminali nel tentativo di porre rimedio a malattie o difetti dannosi (a differenza della clonazione riproduttiva, che mira a riprodurre un organismo). Mentre alcuni hanno incontrato resistenza agli sforzi di clonazione terapeutica a causa di considerazioni bioetiche, nuove scoperte hanno identificato ulteriori opportunità per le terapie con cellule staminali. Ad esempio, Freda Miller ed Elaine Fuchs, lavorando indipendentemente, hanno scoperto cellule staminali in diversi strati della pelle. Queste cellule aiutano la pelle a ripararsi e la loro scoperta potrebbe avere applicazioni nel trattamento delle malattie della pelle e potenzialmente di altre condizioni, come i danni ai nervi.

Esercizio: la pecora Dolly è stato il primo mammifero a essere clonato. Per creare Dolly, hanno rimosso il nucleo da una cellula uovo di donatrice. Hanno poi introdotto il nucleo di una seconda pecora nella cellula, che si è divisa fino allo stadio di blastocisti prima di impiantarla in una madre surrogata. Pensi che Dolly fosse una pecora Finn-Dorset o una scozzese Blackface?

La de-estinzione (nota anche come biologia della resurrezione o revivalismo delle specie ) è il processo di generazione di un organismo che assomiglia o è una specie estinta . Esistono diversi modi per eseguire il processo di de-estinzione. La clonazione è il metodo più ampiamente proposto, sebbene siano stati presi in considerazione anche l'editing del genoma e l'allevamento selettivo . Tecniche simili sono state applicate a determinate specie in via di estinzione , nella speranza di aumentare la loro diversità genetica . L'unico metodo dei tre che fornirebbe a un animale la stessa identità genetica è la clonazione. Ci sono vantaggi e svantaggi nel processo di de-estinzione che vanno dai progressi tecnologici alle questioni etiche. Sono state create diverse banche dei tessuti, tra cui la " Frozen zoo " presso lo zoo di San Diego , per conservare tessuti congelati provenienti dalle specie più rare e in via di estinzione del mondo. Questa pratica è anche chiamata "clonazione conservativa".

Clonazione della pecora Dolly
Lo stambecco dei pirenei
tecnica di clonaggio

La tecnologia del DNA ricombinante

Con il termine di DNA ricombinante si intende una sequenza di DNA ottenuta artificialmente dalla combinazione di materiale genetico di origini differenti, come può avvenire per un plasmide contenente un gene d'interesse che viene inserito in un batterio. Si usa anche definire proteina ricombinante ogni proteina ottenuta da trascrizione e traduzione di un frammento di DNA ricombinante inserito all'interno di un organismo ospite, che diviene in questo modo geneticamente modificato.

In molti casi questa tecnologia viene utilizzata per produrre proteine (con vari scopi) modificando geneticamente batteri o lieviti. Ad esempio l'insulina, con la tecnica vista sopra del clonaggio genico, è stata ottenuta inserendo il gene umano per l'insulina in un plasmide, che a sua volta viene inserito in un batterio che divento quindi GM. Il batterio viene quindi riprodotto in appositi bioreattori in cui verrà anche espresso il gene inserito producendo quindi l'insulina che verrà estratta purificando il materiale del bioreattore. Quando l'espressione genica richiede un processo metabolico di tipo eucariote, in modo analogo si possono inserire geni esogeni nelle cellule del lievito (un organismo unicellulare eucariote) e coltivarlo in bioreattori come per i batteri, purificando poi le proteine da estrarre.

Bioreattore per la produzione di vaccini
Schema della produzione di insulina con la tecnologia del DNA ricombinante
L'insulina è stato il primo farmaco ottenuto con le biotecnologie moderne

Creare e usare librerie di DNA

Nella biologia molecolare , una libreria genetica è una raccolta di frammenti di DNA di un microbioma che è stato immagazzinato e propagato attraverso metodi di clonazione molecolare . Esistono molti tipi di librerie di geni, comprese librerie di geni parziali (librerie di cDNA), librerie genomiche (formate da l'intero genoma di un dato organismo) e librerie di mutanti casuali (nuovi geni sintetizzati da nucleotidi o codoni sostituiti).

Una libreria di cDNA è una combinazione di frammenti di cDNA clonati ( DNA complementare ) inseriti in una raccolta di cellule ospiti, che costituiscono una parte del trascrittoma dell'organismo e sono immagazzinati come una " libreria ". Il cDNA è prodotto da mRNA completamente trascritto trovato nel nucleo e quindi contiene solo i geni espressi di un organismo. Le librerie cDNA sono comunemente utilizzate quando si riproducono genomi eucariotici, poiché la quantità di informazioni è ridotta per rimuovere il gran numero di regioni non codificanti dalla libreria. Le librerie cDNA sono utilizzate per esprimere geni eucariotici nei procarioti. I procarioti non hanno introni nel loro DNA e quindi non possiedono enzimi in grado di tagliarlo durante il processo di trascrizione.

Gli scienziati possono analizzare campioni di acidi nucleici, come DNA genomico frammentato ed estratti di RNA, per la presenza di determinate sequenze. Gli scienziati progettano ed etichettano brevi frammenti di DNA o sonde con coloranti radioattivi o fluorescenti per facilitare il rilevamento

Tra gli usi che si possono dare ad una biblioteca ci sono:

L'isolamento di sequenze e geni : punto di partenza per lo studio molecolare.
Conservazione del genoma: l'eccezionalità di un campione biologico rende consigliabile la conservazione del suo materiale genetico (resti archeologici, specie in via di estinzione, individui con patologie uniche).
Studio della sequenza genomica: i metodi classici di sequenziamento del DNA prevedevano la [clonazione]] del genoma completo da sequenziare. Lo sviluppo dalla fine degli anni 2000 di metodi di sequenziamento ad alto rendimento o di "prossima generazione" (vedi Sequenziamento del DNA ) consente di rinunciare alla generazione precedente di una libreria.

Amplificare (moltiplicare) geni o frammenti di DNA

Sebbene il DNA genomico sia visibile a occhio nudo quando viene estratto in massa, l'analisi del DNA spesso richiede di concentrarsi su una o più regioni specifiche del genoma. La reazione a catena della polimerasi ( PCR ) è una tecnica che gli scienziati usano per amplificare regioni specifiche del DNA per ulteriori analisi ( Figura sotto ). I ricercatori usano la PCR per molti scopi nei laboratori, come la clonazione di frammenti di geni per analizzare malattie genetiche, l'identificazione di DNA estraneo contaminante in un campione e l'amplificazione del DNA per il sequenziamento. Applicazioni più pratiche includono la determinazione della paternità e la rilevazione di malattie genetiche.

I frammenti di DNA possono anche essere amplificati da uno stampo di RNA in un processo chiamato PCR a trascrittasi inversa (RT-PCR) . Il primo passaggio consiste nel ricreare il filamento stampo di DNA originale (chiamato cDNA) applicando nucleotidi di DNA all'mRNA. Questo processo è chiamato trascrizione inversa. Ciò richiede la presenza di un enzima chiamato trascrittasi inversa. Dopo che il cDNA è stato creato, è possibile utilizzare la PCR normale per amplificarlo.

Collegamento all'apprendimento

Approfondisci la tua comprensione della reazione a catena della polimerasi guardando questo video su Youtube: What is PCR and qPCR? | PCR Animation - di ClevaLab

Il targeting genico (silenziamento genico)

Sebbene i metodi classici di studio della funzione genica inizino con un dato fenotipo e determinino la base genetica di quel fenotipo, le tecniche moderne consentono ai ricercatori di iniziare a livello di sequenza del DNA e di chiedersi: "Cosa fa questo gene o elemento del DNA?" Questa tecnica, la genetica inversa, ha portato a invertire la metodologia genetica classica. Questo metodo sarebbe simile al danneggiamento di una parte del corpo per determinarne la funzione. Un insetto che perde un'ala non può volare, il che significa che la funzione dell'ala è il volo. Il metodo genetico classico confronterebbe gli insetti che non possono volare con gli insetti che possono volare e osserverebbe che gli insetti non volanti hanno perso le ali. Allo stesso modo, la mutazione o l'eliminazione dei geni fornisce ai ricercatori indizi sulla funzione genica. Chiamiamo collettivamente i metodi che usano per alterare la funzione genica targeting genico e tra questi il più usato è il knock out genico (o silenziamento genico). Il targeting genico si ottiene con l'uso di vettori di DNA ricombinante per alterare l'espressione di un gene particolare, sia introducendo mutazioni in un gene, sia eliminando l'espressione di un certo gene eliminando una parte o tutta la sequenza genica dal genoma dell'organismo.

Il gene targeting è una tecnica genetica per sostituire un gene esistente con uno mutato (cambiato). Può essere fatto su topi da laboratorio o su qualche altro organismo modello. Il metodo può essere utilizzato per eliminare un gene, rimuovere sezioni di controllo, aggiungere un gene e introdurre mutazioni puntiformi. Il targeting genico può essere permanente o condizionale. Le condizioni, ad esempio, possono essere un momento specifico durante lo sviluppo nella vita dell'organismo o limitate a un tessuto specifico. Ad oggi, questo metodo è stato applicato a numerose specie tra cui Drosophila melanogaster, tabacco, mais, cellule, umane, topi e ratti.

Ad esempio per silenziare un gene nei topi, viene creato un "costrutto di DNA" (un segmento di DNA che contiene il gene mutato), solitamente nei batteri . Il costrutto ha il gene mutato o parte di esso, e un gene reporter, che può essere un marcatore selezionabile . Il DNA mutato viene inserito in un genoma di cellule staminali derivato da un embrione.

Più recentemente il targeting genico può essere fatto anche con l'editing genico tramite la tecnica CRISPR Cas9.

Fenotipi devianti indotti col KO genico (silenziamento genico)
Schema che aiuta a comprendere le differenze tra modifica genetica, editing genomico ed targeting genico.
Un topo da laboratorio in cui è stato eliminato un gene che influenza la crescita dei peli (a sinistra) è raffigurato accanto a un normale topo da laboratorio.
Un topo knockout (a sinistra) che è un modello di obesità, confrontato con un topo normale

Sequenziare il DNA

Sebbene negli ultimi anni ci siano stati notevoli progressi nelle scienze mediche, i dottori sono ancora confusi da alcune malattie e stanno usando il sequenziamento dell'intero genoma per scoprire la radice del problema. Il sequenziamento dell'intero genoma è un processo che determina la sequenza del DNA di un intero genoma. Il sequenziamento dell'intero genoma è un approccio basato sulla forza bruta per risolvere i problemi quando c'è una base genetica al centro di una malattia. Diversi laboratori ora forniscono servizi per sequenziare, analizzare e interpretare interi genomi.

Ad esempio, il sequenziamento dell'intero esoma è un'alternativa più economica al sequenziamento dell'intero genoma. Nel sequenziamento dell'intero esoma, il medico sequenzia solo le regioni codificanti e produttrici di esoni del DNA. Nel 2010, i medici hanno utilizzato il sequenziamento dell'intero esoma per salvare un bambino i cui intestini presentavano molteplici ascessi misteriosi. Il bambino è stato sottoposto a diverse operazioni al colon senza alcun sollievo. Infine, hanno eseguito il sequenziamento dell'intero esoma, che ha rivelato un difetto in un percorso che controlla l'apoptosi (morte cellulare programmata). I medici hanno utilizzato un trapianto di midollo osseo per superare questo disturbo genetico, portando a una cura per il bambino. È stata la prima persona a ricevere un trattamento di successo basato su una diagnosi di sequenziamento dell'intero esoma. Oggi, il sequenziamento del genoma umano è più facilmente disponibile e i risultati sono disponibili entro due giorni per circa $ 1000.

Sequenziamento del DNA col metodo Sanger

Fino agli anni '90, il sequenziamento del DNA (lettura della sequenza del DNA) era un processo relativamente costoso e lungo. L'uso di nucleotidi radiomarcati aggravava il problema anche per questioni di sicurezza. Con la tecnologia attualmente disponibile e le macchine automatizzate, il processo è più economico, più sicuro e può essere completato in poche ore. Fred Sanger ha sviluppato il metodo di sequenziamento utilizzato per il progetto di sequenziamento del genoma umano, che è ampiamente utilizzato oggi ( galleria sotto).

Animazione. Visitate questo sito per guardare un video che spiega la tecnica di lettura della sequenza del DNA sviluppata grazie al lavoro di Sanger.

Il metodo di sequenziamento è noto come metodo di terminazione della catena dideossi. Il metodo si basa sull'uso di terminatori di catena, i dideossinucleotidi (ddNTP). I ddNTP differiscono dai deossinucleotidi per la mancanza di un gruppo OH 3' libero sullo zucchero a cinque atomi di carbonio. Se un ddNTP viene aggiunto a un filamento di DNA in crescita, la catena non può essere ulteriormente estesa perché il gruppo OH 3' libero necessario per aggiungere un altro nucleotide non è disponibile. Utilizzando un rapporto predeterminato di deossinucleotidi e dideossinucleotidi, è possibile generare frammenti di DNA di diverse dimensioni.

Il campione di DNA da sequenziare viene denaturato (separato in due filamenti riscaldandolo ad alte temperature). Il DNA viene diviso in quattro provette in cui vengono aggiunti un primer, una DNA polimerasi e tutti e quattro i nucleosidi trifosfati (A, T, G e C). Inoltre, quantità limitate di uno dei quattro dideossinucleoside trifosfati (ddCTP, ddATP, ddGTP e ddTTP) vengono aggiunte a ciascuna provetta rispettivamente. Le provette sono etichettate come A, T, G e C in base al ddNTP aggiunto. Ai fini del rilevamento, ciascuno dei quattro dideossinucleotidi porta un'etichetta fluorescente diversa. L'allungamento della catena continua finché non viene incorporato un dideossi nucleotide fluorescente, dopodiché non si verifica alcun ulteriore allungamento. Dopo che la reazione è terminata, viene eseguita l'elettroforesi. È possibile rilevare anche una differenza di lunghezza di una singola base. La sequenza viene letta da uno scanner laser che rileva il marcatore fluorescente di ciascun frammento. Per il suo lavoro sul sequenziamento del DNA, Sanger ricevette il premio Nobel per la chimica nel 1980.

Il sequenziamento Sanger
di-desossiribonucleotidi fluorescenti
Macchine per il sequenziamento automatico
Sequenziamento a nanopori

Sequenziamento di nuova generazione

Dal 2005, le tecniche di sequenziamento automatizzato utilizzate dai laboratori rientrano nel sequenziamento di nuova generazione (deep sequencing o massively parallel sequencing), che è un gruppo di tecniche automatizzate utilizzate per il sequenziamento rapido del DNA. Questi sequenziatori automatizzati a basso costo possono generare sequenze di centinaia di migliaia o milioni di frammenti corti (da 25 a 500 coppie di basi) nell'arco di un giorno. Questi sequenziatori utilizzano software sofisticati per superare il macchinoso processo di mettere in ordine tutti i frammenti.

Tra i metodi moderni, veloci e a basso costo, c'è quello a nanopori; guarda l'animazione in questo video su Youtube: How nanopore sequencing works di Oxford Nanopore Technologies.

Genoma dei Neanderthal: come siamo imparentati?
La prima bozza di sequenza del genoma dei Neanderthal è stata recentemente pubblicata da Richard E. Green et al. nel 2010. 1 I Neanderthal sono gli antenati più prossimi degli esseri umani odierni. Si sa che vivevano in Europa e nell'Asia occidentale (e ora, forse, nell'Africa settentrionale) prima di scomparire dai reperti fossili circa 30.000 anni fa. Il team di Green ha studiato resti fossili di quasi 40.000 anni fa selezionati da siti in tutto il mondo. Sono stati impiegati mezzi estremamente sofisticati di preparazione dei campioni e sequenziamento del DNA a causa della natura fragile delle ossa e della forte contaminazione microbica. Nel loro studio, gli scienziati sono stati in grado di sequenziare circa quattro miliardi di coppie di basi. La sequenza dei Neanderthal è stata confrontata con quella degli esseri umani odierni provenienti da tutto il mondo. Dopo aver confrontato le sequenze, i ricercatori hanno scoperto che il genoma dei Neanderthal aveva una somiglianza maggiore del 2-3 percento con le persone che vivevano fuori dall'Africa rispetto alle persone in Africa. Mentre le teorie attuali suggeriscono che tutti gli esseri umani odierni possano essere ricondotti a una piccola popolazione ancestrale in Africa, i dati del genoma dei Neanderthal suggeriscono alcuni incroci tra i Neanderthal e i primi esseri umani moderni. Green e i suoi colleghi hanno anche scoperto segmenti di DNA tra le persone in Europa e Asia che sono più simili alle sequenze dei Neanderthal che ad altre sequenze umane contemporanee. Un'altra osservazione interessante è stata che i Neanderthal sono strettamente imparentati con le persone della Papua Nuova Guinea come con quelle della Cina o della Francia. Ciò è sorprendente perché i resti fossili dei Neanderthal sono stati localizzati solo in Europa e nell'Asia occidentale. Molto probabilmente, lo scambio genetico ha avuto luogo tra i Neanderthal e gli esseri umani moderni quando gli esseri umani moderni sono emersi dall'Africa, prima della divergenza tra europei, asiatici orientali e papuani. Diversi geni sembrano aver subito modifiche dai Neanderthal durante l'evoluzione degli esseri umani odierni. Questi geni sono coinvolti nella struttura cranica, nel metabolismo, nella morfologia della pelle e nello sviluppo cognitivo. Uno dei geni di particolare interesse è RUNX2 , che è diverso negli esseri umani odierni e nei Neanderthal. Questo gene è responsabile dell'osso frontale prominente, della gabbia toracica a campana e delle differenze dentali osservate nei Neanderthal. Si ipotizza che un cambiamento evolutivo in RUNX2 sia stato importante nell'origine degli esseri umani odierni e che abbia interessato il cranio e la parte superiore del corpo.


Confronto delle sequenze
Un allineamento di sequenze è una disposizione di proteine, DNA o RNA. Gli scienziati lo usano per identificare regioni simili tra tipi di cellule o specie, il che può indicare la conservazione di funzioni o strutture. Possiamo usare gli allineamenti di sequenze per costruire alberi filogenetici. Il seguente sito web usa un programma software chiamato BLAST (basic local alignment search tool) . In "Web Blast", fai clic su "Nucleotide Blast". Inserisci la seguente sequenza nella grande casella "query sequence": ATTGCTTCGATTGCA. Sotto la casella, individua il campo "Organism" e digita "human" o "Homo sapiens". Quindi fai clic su "BLAST" per confrontare la sequenza inserita con le sequenze note del genoma umano. La ricerca richiederà un po' di tempo prima che i risultati vengano visualizzati. Il risultato è che questa sequenza si verifica in oltre cento punti nel genoma umano. Viene presentato un elenco di descrizioni delle corrispondenze. Fai clic sulla scheda Graphic Summary sopra i risultati e i risultati verranno presentati con le barre orizzontali e vedrai una breve descrizione di ciascuno dei risultati corrispondenti. Scegli uno dei risultati vicino alla parte superiore dell'elenco e fai clic su alignment, quindi nella nuova finestra fai clic su "Graphics". Questo ti porterà a una pagina che mostra la posizione della sequenza all'interno dell'intero genoma umano. Puoi spostare avanti e indietro il cursore che sembra una bandiera colorata per visualizzare immediatamente le sequenze attorno al gene selezionato. È quindi possibile tornare alla sequenza selezionata cliccando sul pulsante "ATG".

Utilizzo di sequenze del genoma intero di organismi modello

Il biochimico britannico e premio Nobel Fred Sanger ha utilizzato un virus batterico, il batteriofago fx174 (5368 coppie di basi), per sequenziare completamente il primo genoma. Altri scienziati hanno in seguito sequenziato diversi altri genomi di organelli e virali. Il biotecnologo, biochimico, genetista e imprenditore americano Craig Venter ha sequenziato il batterio Haemophilus influenzae negli anni '80. Circa 74 laboratori diversi hanno collaborato al sequenziamento del genoma del lievito Saccharomyces cerevisiae , iniziato nel 1989 e completato nel 1996, perché era 60 volte più grande di qualsiasi altro sequenziamento del genoma. Nel 1997, erano disponibili le sequenze del genoma di due importanti organismi modello: il batterio Escherichia coli K12 e il lievito Saccharomyces cerevisiae . Ora conosciamo i genomi di altri organismi modello, come il topo Mus musculus , il moscerino della frutta Drosophila melanogaster , il nematode Caenorhabditis. elegans e l'uomo Homo sapiens . I ricercatori svolgono un'ampia ricerca di base sugli organismi modello perché possono applicare le informazioni a organismi geneticamente simili. Un organismo modello è una specie che i ricercatori usano come modello per comprendere i processi biologici in altre specie che l'organismo modello rappresenta. Avere interi genomi sequenziati aiuta con gli sforzi di ricerca in questi organismi modello.

Collegamento all'apprendimento

Clicca su ogni passaggio del sequenziamento del genoma in questo sito .

Utilizzi della sequenza del genoma

Un uso è quello di riconoscere i geni responsabili di un qualche fenotipo, questo viene fatto grazie al microarray di DNA (comunemente conosciuto come gene chip, chip a DNA, biochip o matrici ad alta densità). Si tratta di un insieme di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (matrice). Tali array permettono di esaminare simultaneamente la presenza di moltissimi geni all'interno di un campione di DNA (che spesso può rappresentare anche tutto il genoma o il trascrittoma di un organismo). Un utilizzo tipico è quello di confrontare il profilo di espressione genica di un individuo malato con quello di uno sano per individuare quali geni sono coinvolti nella malattia. I microarray sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, che consiste nel fissare tutti i segmenti di DNA (detti probe) su un supporto e nel marcare invece l'acido nucleico che vogliamo identificare (detto target). È una tecnica che è stata sviluppata negli anni '90 e oggi permette l'analisi dell'espressione genica monitorando in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni.

Fasi coinvolte in un esperimento di DNA microarray
Fasi coinvolte in un esperimento di DNA microarray
chip del microarray
Ibridazione delle sonde del pozzetto
Funzionamento del microarray

Conoscere l'intero genoma consentirà ai ricercatori di scoprire in anticipo malattie future e altri disturbi genetici. Ciò consentirà decisioni più consapevoli sullo stile di vita, i farmaci e l'avere figli. La genomica è ancora agli inizi, anche se un giorno potrebbe diventare di routine usare il sequenziamento dell'intero genoma per esaminare ogni neonato per rilevare anomalie genetiche.

Oltre alle malattie e alla medicina, la genomica può contribuire allo sviluppo di nuovi enzimi che convertono la biomassa in biocarburante, il che si traduce in una maggiore produzione di raccolti e carburante e in costi inferiori per i consumatori. Questa conoscenza dovrebbe consentire metodi migliori di controllo sui microbi che l'industria utilizza per produrre biocarburanti. La genomica potrebbe anche migliorare i metodi di monitoraggio che misurano l'impatto degli inquinanti sugli ecosistemi e aiutano a ripulire i contaminanti ambientali. La genomica ha aiutato nello sviluppo di prodotti agrochimici e farmaceutici che potrebbero giovare alla scienza medica e all'agricoltura.

Sembra fantastico avere tutta la conoscenza che possiamo ottenere dal sequenziamento dell'intero genoma; tuttavia, gli esseri umani hanno la responsabilità di usare questa conoscenza saggiamente. Altrimenti, potrebbe essere facile abusare del potere di tale conoscenza, portando a discriminazioni basate sulla genetica di una persona, sull'ingegneria genetica umana e su altre preoccupazioni etiche. Queste informazioni potrebbero anche portare a problemi legali riguardanti la salute e la privacy.

L'editing genomico

L'Editing genomico è un tipo di ingegneria genetica in cui il DNA è inserito, cancellato, modificato, o rimpiazzato dal genoma dell'organismo vivente. A differenza delle prime tecniche di ingegneria genetica che casualmente inserivano materiale genetico in un genoma ospite, l'editing genomico agisce in siti specifici. Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi per modificare il genoma in modo preciso e agile. Attualmente sono noti tre metodi per modificare un genoma: ZNF , TALEN e CRISPR/Cas9. Quest'ultimo è il più recente e sofisticato e a basso costo di implementazione, su cui moti scienziati si stanno concentrando.

L'acronimo CRISPR sta per "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" e identifica una tecnica di ingegneria genetica usata in biologia molecolare. Si basa su una versione semplificata di un sistema di difesa contro i virsus che si trova nei batteri (CRISPR-Cas9). In pratica CRISPR è una "biblioteca" batterica di frammenti di DNA virali e i batteri la usano per riconoscerli in caso di infezione e nel caso tagliarli per disattivarli.

Fornendo la nucleasi Cas9 complessata con un RNA guida sintetico (gRNA) in una cellula, il genoma della cellula può essere tagliato nella posizione desiderata, consentendo la rimozione dei geni esistenti e/o l'aggiunta di nuovi in vivo. La tecnica è considerata molto significativa nel campo della biotecnologia e della medicina poiché consente di modificare i genomi in vivo in modo molto preciso, economico e semplice. Può essere utilizzato nella creazione di nuovi medicinali, prodotti agricoli e organismi geneticamente modificati o come mezzo per controllare agenti patogeni e parassiti. Ha anche possibilità di uso nel trattamento delle malattie genetiche ereditarie e delle malattie derivanti da mutazioni somatiche come il cancro. Sebbene ampiamente accettata in ambito agrario e biotecnologico, il suo utilizzo nella modificazione genetica della linea germinale umana è ad oggi molto controverso. Lo sviluppo della tecnica è valso a Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier il Premio Nobel per la Chimica nel 2020.

Funzionando come una forbice genetica, la nucleasi Cas9 apre entrambi i filamenti della sequenza del DNA bersaglio per introdurre la modifica. Le mutazioni knock-in, facilitate tramite la riparazione diretta per omologia (HDR, è il meccanismo che nelle cellule ripara le lesioni della catena del DNA), rappresentano il percorso tradizionale degli approcci mirati di editing genomico. Questo consente l’introduzione di fattori di riparazione mirati del DNA.

Il sistema di difesa CRISPR
Schema di funzionamento di CRISPR/CAs9
Cas9 vs Cas12a
I due metodi di riparazione del DNA tagliato