La Serie A1 1999-2000 è stata l'81ª edizione della massima serie del campionato italiano maschile di pallanuoto.
In questa edizione si sono tornati a disputare i Play-off secondo la formula tradizionale, con la qualificazione delle prime otto che si sfidate al meglio di tre gare (ad esclusione della finale, al meglio di cinque), mentre le ultime quattro hanno disputato il girone di Play-out.
Il Posillipo ha vinto il suo nono titolo nazionale chiudendo al comando la stagione regolare e battendo la Rari Nantes Florentia in finale.